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Aislamiento e identificación de bacterias solubilizadoras de fosfatos (BSF) asociadas a la rizósfera de vanilla spp.
(Pontificia Universidad Javeriana Cali, 2019) García Marulanda, Zeneth Vanessa; Mosquera Espinosa, Ana Teresa; Flanagan, Nicola Sian
Los suelos de la región biogeográfica del Choco en la costa pacífica colombiana son altamente ácidos, lo que conduce a una baja disponibilidad de nutrientes para las plantas, en particular el fósforo. Una estrategia adoptada por las plantas a los suelos ácidos es la asociación con microorganismos de la rizósfera, tanto hongos como bacterias, que contribuyen a mejorar la disponibilidad de los nutrientes. La estrategia adoptada por las bacterias rizosféricas solubilizadoras de fosfato contribuyen a mejorar la eficiencia de utilización del mismo. En la presente investigación se evaluó el aislamiento e identificación de bacterias solubilizadoras de fosfato asociadas a la rizósfera de plantas silvestres de Vanilla spp. Para lo cual, se planteó como objetivos: 1) Identificar el mejor medio de cultivo selectivo y la mejor dilución para el aislamiento de Bacterias Solubilizadoras de Fosfato (BSF); 2) Estandarizar la metodología para la preservación y reactivación de BSF; 3) Identificar a nivel molecular, las especies bacterianas presentes en la rizósfera de algunas especies silvestre de Vanilla. De seis especies de Vanilla colectadas en dos municipios del Valle del Cauca fue posible obtener un total de 612 aislamientos, de los cuales 100 fueron seleccionados por morfotipo y de estos 65 fueron identificados hasta especie.. Para considerar el mejor medio de cultivo selectivo y dilución se realizó la prueba de Regresión de Poisson, la cual indicó el medio Pikovskaya (PVK) y la dilución 10-4 como las mejores condiciones para el aislamiento de BSF. La estandarización de la metodología de preservación y reactivación de las BSF mediante el análisis de prueba de Fisher permitió identificar que se pierde el 25% de la población total preservada seis (6) meses después de su preservación. De igual forma, la identificación de los aislamientos se realizó mediante la secuenciación de la región ribosomal 16S y búsquedas BLAST en GenBank predominando géneros como Burkholderia y Bacillus.
Caracterización de potenciales hongos micorrízicos aislados de plantas adultas y semillas cebo de la orquídea amenazada, Cattleya quadricolor Lindl (Orchidaceae)
(Pontificia Universidad Javeriana Cali, 2022) Ramírez Bejarano, Erika Vanessa; Mosquera Espinosa, Ana Teresa; Ventre Lespiaucq, Agustina; Flanagan, Nicola Sian
Las orquídeas establecen una simbiosis obligatoria con Hongos Micorrízicos Orquidioides (HMO), fundamentales para la germinación de las semillas y el apoyo a la nutrición en plantas adultas. La especificidad de la relación que se establece entre orquídea-HMO varía según las especies e incluso entre las diferentes etapas de vida de la planta. El presente estudio, tuvo como objetivos aislar, caracterizar morfológica y molecularmente para comparar la diversidad de potenciales hongos micorrízicos de plantas adultas y semillas cebo de Cattleya quadricolor, una orquídea epífita y endémica del Valle geográfico del río Cauca en Colombia. Esta especie estaamenazada (EN) producto de la degradación de su hábitat natural, el Bosque Seco Tropical (BST) y de la extracción ilegal para el comercio de plantas. Se hicieron muestreos aleatorios y se tomaron tres porciones de raíces en nueve plantas de C. quadricolor. Además, se colocaron paquetes con semillas cebo para la captura de HMO durante dos períodos: 63 y 181 días, después de su instalación. Se aislaron en cultivo puro posibles hongos micorrízicos y se identificaron mediante el código de barras de la vida de la región rRNA-ITS. Las secuencias fueron editadas y alineadas en Geneious 6.0.6 y se compararon con secuencias de GenBank. Se aislaron e identificaron 26 cepas fúngicas, de las cuales, se determinaron tres aislamientos de potenciales HMO aislados a partir raíces de plantas adultas; dos de los aislamientos corresponden al género Tulasnella y uno al género Ceratobasidium. De la metodología de semillas cebo no se obtuvieron aislamientos de potenciales HMO. Dos análisis filogenéticos fueron realizados en MEGA 11.0.11 para el género Tulasnella y Ceratobasidium. Se encontró que los dos aislados de Tulasnella pertenecen a clados distantes, donde uno, tiende a establecer relaciones limitadas a ciertos taxones de orquídeas, a comparación del otro. El aislado de Ceratobasidium, por su lado, es cercano a hongos reportados como endófitos, micorrízicos y fitopatógenos de diferentes orquídeas y taxones de plantas en el planeta, incluyendo a Buenaventura en el departamento del Valle del Cauca, Colombia. Además, se obtuvo hongos reportados como endófitos, donde resaltan posibles Hongos Endófitos Septados Oscuros (HESO), pertenecientes a los géneros Aaosphaeria y Colletotrichum. Los hongos aislados en cultivo puro se conservaron ex situ para futuras pruebas de germinación simbiótica in vitro. Este es el primer estudio sobre la diversidad de hongos con potencial benéfico aislados de C. quadricolor, que determina taxones de potenciales HMO para apoyar la germinación de semillas y proporciona conocimiento sobre las 9 posibles asociaciones micorrízicas de C. quadricolor en su etapa adulta. Este estudio representa un importante recurso biológico para la restauración de las poblaciones de esta orquídea endémica y en grave peligro de extinción.
Caracterización molecular y análisis filogenético de fusarium spp. asociado al cultivo de vainilla y sus parientes silvestres en el Valle del Cauca
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2023) Rodríguez Bastidas, Yiseth Jayerlin; Mosquera Espinosa, Ana Teresa; Flanagan, Nicola Sian
Las enfermedades causadas por hongos fitopatógenos inducen grandes pérdidas económicas alrededor del mundo. Uno de los cultivos afectados es el de vainilla, con la especie comercial Vanilla planifolia, una orquídea de interés en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica. Existen diversos hongos patógenos asociados a sus enfermedades, sin embargo, la pudrición de tallo y raíz ocasionada por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. vanillae (Fov) y la pudrición de cuello de raíz y raíces terrestres ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. radicis-vanillae (Forv), denominadas fusariosis, constituyen la principal limitante en los planes de expansión de este cultivo. En Colombia, la vainilla es un cultivo reciente por lo que se tiene un bajo nivel de conocimiento sobre su manejo agronómico y en especial fitosanitario. Estohace necesario realizar la caracterización molecular de los agentes patógenos que ocasionan fusariosis y avanzar con la información sobre la fitopatología de vainilla en el país. En el presente estudio se caracterizó molecularmente aislamientos del género Fusarium obtenidos de plantas de Vanilla planifoliay sus parientes cercanos a partir de secuenciación de regiones específicas del genoma con aplicación para el diagnóstico molecular, ITS-rRNA y EF1- α. Utilizando el motor de búsqueda BLAST, se identificaron las secuencias con mayor similitud en GenBank, y se desarrollaron análisis filogenéticos para cada locus, incluyendo cepas de F. oxysporum aislados de vainilla y reportados previamente en la literatura. Se generaron secuencias de ADN para ITS-rRNA (24 aislamientos) y EF1- α (14 aislamientos). Al secuenciar una cepa para ambos loci, las identificaciones moleculares fueron iguales que correspondieron a F. oxysporum (12 cepas), F. solani (5 cepas), F. verticillioides (3 cepas), F. concentricum (2 cepas), F. pseudocircinatum (2 cepas) y F. proliferatum (1 cepa). En el locus ITS-rRNA, se evidenció la afinidad de los aislados de F. oxysporum a la f.sp. vanillae. En la filogenia del locus EF1- α las secuencias disponibles para Forv se agrupan con las de Fov, indicando sus genotipos en este locus son indistinguibles. Por ende, se confirma la presencia en plantas de V. planifolia en condiciones circa situm en Colombia de hongos con genotipos afín a Fov y Forv. Los resultados permiten esclarecer la relación entre Fov y Forv y entender el estado fitosanitario de la vainilla en condiciones circa situm, con el fin de diseñar planes de manejo integrado de enfermedades, así como también el desarrollo de buenas prácticas agroecológicas para programas de conservación y uso sostenible.
Efecto estacional sobre la diversidad ecológica y filogenética de la comunidad de hormigas a través de niveles de transformación ambiental del bosque seco tropical interandino
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2021) Lozano Arcila, María Camila; Flanagan, Nicola Sian
Los bosques secos tropicales (BST) interandinos son ecosistemas caracterizados porprecipitaciones biomodales y extensos periodos de sequía, altos niveles de endemismo y además son altamente amenazados por perturbaciones antropogénicas. Las comunidades de hormigas conforman un grupo clave para monitorear el estado de conservación de los ecosistemas, por sus altos niveles de sensibilidad ante los cambios funcionales y estructurales del ambiente. El uso conjunto de la diversidad ecológica y filogenética en estudios de comunidades de hormigas del BST interandino no se ha hecho hasta la fecha, pero la complementariedad de ambas métricas puede ser de utilidad para observar efectos de las perturbaciones del hábitat en la riqueza de especies y los linajes evolutivos. En este estudio se evaluaron los patrones de diversidad ecológica y filogenética alpha y beta en comunidades de hormigas del BST de la cuenca del río Aipe. Y se compararon estos índices entre las temporadas estacionales (sequía y lluvia) a través de nueves parcelas registrando diferentes niveles de transformación y permanencia, además del impacto de la presencia de especies invasoras sobre los índices. En cuanto al efecto de las temporadas estacionales, se evidenció que los valores de diversidad ecológica y filogenética de las comunidades de hormigas difieren entre estaciones, con la sequía mostrando los menores niveles de diversidad ecológica y filogenética alpha y una estructura filogenética que evidencia procesos de exclusión competitiva. Para la diversidad beta en ambas temporadas estacionales las parcelas difieren entre sí, pero resalta el efecto de la sequía al aumentar el rango de diversidad ecológica y filogenética beta entre las parcelas. En cuanto a los niveles de transformación y permanencia, para las dos temporadas estacionales la permanencia influye significativamente en la diversidad ecológica y filogenética, pero es en la sequía donde el nivel bajo y medio de permanencia afecta la comunidad. Y el impacto de la presencia de las especies invasoras en la comunidad de hormigas es más visible en la temporada de sequía, donde representan un componente importante de la diversidad ecológica y filogenética. En conclusión, la temporada de sequía y su efecto estresante sobre la disponibilidad de alimentos y sitios de anidación, afecta de forma heterogénea la diversidad ecológica y filogenética de la comunidad de hormigas de la cuenca del río Aipe. Por lo que se recomienda a futuros estudios de diversidad en bosque seco tropical muestrear las dos temporadas estacionales.
Guía práctica : implementación de metodologías para el aislamiento, preservación y uso de hongos micorrízicos de orquídeas
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2024) Ramírez Bejarano, Erika Vanessa; Flanagan, Nicola Sian; Ventre Lespiaucq, Agustina; Mosquera Espinosa, Ana Teresa
El presente manuscrito proporciona información detallada de la relación entre orquídeas y hongos benéficos que participan de su nutrición, dicho de manera técnica las micorrizas orquidioides, destacando la importancia de estos hongos en la conservación y adaptación de las orquídeas. Se presentan los procedimientos claves, desde la observación en campo de las orquídeas en su hábitat natural hasta la extracción en laboratorio de sus hongos simbiontes que están en las raíces formando pelotones. Se describe en detalle los protocolos de aislamiento, identificación, preservación y uso de los hongos micorrízicos que son esenciales para la germinación en campo y laboratorio de las semillas microscópicas de las orquídeas. Lo anterior es fundamental, para la recuperación de poblaciones de plantas tan amenazadas por malas prácticas de los humanos, por lo tanto, el material que se brinda es de importancia práctica y teórica en la conservación de la biodiversidad vegetal. Finalmente, se espera que esta cartilla sea un recurso integral no solo para investigadores, sino conservacionistas y amantes de las orquídeas interesados en contribuir a la protección de las mismas. Reunir varias áreas de estudio, como ecología, microbiología y técnicas moleculares principalmente, proporciona bases sólidas para el estudio y la aplicación de estrategias que propenden por el cuidado y protección efectivas de estas maravillosas plantas en peligro poniendo foco a los hongos micorrízicos orquidioides.
Guía práctica: Implementación de metodologías para el aislamiento, preservación y uso de hongos micorrízicos de orquídeas
(Sello Editorial Javeriano, 2024) Ramírez Bejarano, Erika Vanessa; Flanagan, Nicola Sian; Ventre Lespiaucq, Agustina; Mosquera Espinosa, Ana Teresa
El presente manuscrito proporciona información detallada de la relación entre orquídeas y hongos benéficos que participan de su nutrición, dicho de manera técnica las micorrizas orquidioides, destacando la importancia de estos hongos en la conservación y adaptación de las orquídeas. Se presentan los procedimientos claves, desde la observación en campo de las orquídeas en su hábitat natural hasta la extracción en laboratorio de sus hongos simbiontes que están en las raíces formando pelotones. Se describe en detalle los protocolos de aislamiento, identificación, preservación y uso de los hongos micorrízicos que son esenciales para la germinación en campo y laboratorio de las semillas microscópicas de las orquídeas. Lo anterior es fundamental, para la recuperación de poblaciones de plantas tan amenazadas por malas prácticas de los humanos, por lo tanto, el material que se brinda es de importancia práctica y teórica en la conservación de la biodiversidad vegetal. Finalmente, se espera que esta cartilla sea un recurso integral no solo para investigadores, sino conservacionistas y amantes de las orquídeas interesados en contribuir a la protección de las mismas. Reunir varias áreas de estudio, como ecología, microbiología y técnicas moleculares principalmente, proporciona bases sólidas para el estudio y la aplicación de estrategias que propenden por el cuidado y protección efectivas de estas maravillosas plantas en peligro poniendo foco a los hongos micorrízicos orquidioides.
Identificación molecular y morfológica de potenciales hongos micorrízicos orquidioides de Cattleya quadricolor Lindl. 1853
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2023) Hernández Delgadillo, Gerardo Antonio; Flanagan, Nicola Sian; Mosquera Espinosa, Ana Teresa
La familia de plantas Orchidaceae es una de las más diversas del planeta ocupando una gran diversidad de ecosistemas. Colombia es el país con mayor diversidad de orquídeas del mundo albergando 4.270 especies de las cuales 1.572 son especies endémicas, que hasta la fecha 441 especies de orquídeas alojadas dentro de 33 géneros han sido evaluadas para su estado de conservación, con 240 clasificadas en diferentes grados de amenaza (CR - 23; EN - 84; VU – 133) y 77 como datos deficientes. Las orquídeas presentan una interacción ecológica muy estrecha con hongos micorrízicos orquidioides (HMO) para la germinación de sus semillas debido a que estas carecen de reservas de nutrientes para poder germinar, además el grado de interacción varía de forma espacial, temporal y entre grupos taxonómicos. La implementación de los planes de manejo de orquídeas amenazadas ha tenido grandes falencias con respecto al conocimiento de la diversidad de HMO presentes en la interacción micorrízica. Cattleya quadricolor, es una especie endémica del Bosque Seco Tropical (BST) del Valle del Cauca, con estatus de conservación EN (en peligro), de la cual se carece de conocimientos de sus HMO. A partir del estudio se aisló un potencial HMO de C. quadricolor el cual se sometió a una metodología que indujo el estado teleomorfo del hongo y a partir de la descripción molecular y morfológica, y comparación de especies cercanas al hongo aislado se afirma que se obtuvo el teleomorfo (reproducción sexual) de Tulasnella amonilioides, especie que no se ha descrito en su teleomorfo. Por último, el aislamiento y caracterización del potencial HMO permite su aplicación en acciones de restauración de poblaciones, además se obtiene un protocolo que puede inducir la fase sexual (teleomorfo) en HMO.
Optimización de primers de PCR para el diagnóstico de especies de orquídeas en Colombia mediante Código de Barras de la Vida
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2021) Navia Samboni, Yeison Andrés; Flanagan, Nicola Sian
La identificación de especies es esencial para conocer y descifrar la biodiversidad. El Código de Barras de la Vida (DNA barcode), es una herramienta molecular de identificación rápida y precisa que usa regiones semi-conservadas del genoma. Sin embargo, en plantas no hay un acuerdo sobre qué región del genoma sirven para actuar como códigos de barra de la vida universales en plantas. Además, para los loci sugeridos existen dos o más distintos pares de primers. Este trabajo evalúa la eficiencia en términos de éxito de amplificación de PCR y de variabilidad genética de seis loci, cinco del genoma del cloroplasto, matK, trnH-psbA, rbcL, ycf1-3’ y ycf1-5’, y un locus del genoma nuclear, rRNA-ITS, a través de un panel de ocho especies que representan las cuatro subfamilias de orquídeas presentes en Colombia. Al mismo tiempo, se optimizaron las condiciones de la PCR para temperatura de anillamiento de los primers y la concentración del Mg. Los resultados sugieren el uso del locus rRNA-ITS con los primers 17SE y 26SE para el diagnóstico de especies de orquídeas colombianas. Seaplicaron la estandarización de la metodología y el locus seleccionado anteriormente para elcaso de estudio sobre una comunidad de seis morfotipos del género Vanilla, en el municipio de Bahía Solano, Chocó. Cinco morfotipos fueron identificados hasta especie, basado en caracterización morfológica y genética; y un morfotipo no fue posible identificarlo morfológicamente. También se corroboró que el locus rRNA-ITS, presenta mayor variación interespecífica, lo que contribuye adecuadamente en el diagnóstico a nivel de especie en la familia Orchidaceae en Colombia.
Valoración del potencial de la rana invasora eleutherodactylus Johnstonei como vector del hongo patógeno batrachochytrium dendrobatidis
(Pontificia Universidad Javeriana de Cali, 2021) Rodríguez Betancourt, Andrés Felipe; Flechas, Sandra Victoria; Flanagan, Nicola Sian
La quitridiomicosis, causada por el hongo microscópico Batrachochytrium dendrobatidis(Bd), es al día de hoy una de las principales amenazas hacia la supervivencia de los anfibios a nivel mundial. Su incidencia sobre 501 especies y la marcada variación en los grados de tolerancia al patógeno por parte de éstas, plantea la necesidad de monitorear la incidencia de Bd en ensamblajes de anfibios de manera continua. Un factor a considerar al momento de entender la dispersión del hongo hacia ambientes nuevos es la introducción de especies invasoras a nuevos hábitats por medios antrópicos, más aún cuando se tienen registros de altos niveles de tolerancia a la infección por parte de algunas de estas especies. Este estudio, plantea la primera valoración en Suramérica de la prevalencia de Bd sobre la especie invasora Eleutherodactylus johnstonei. Se muestrearon 124 individuos, de los cuales 104 corresponden a E. johnstonei, 2 a Boana xerophylla, 12 a Dendropsophus columbianus y 6 a Scinax ruber en seis localidades de la zona periurbana del municipio de Jamundí. Se realizó extracción de DNA usando GeneReleaser (Bioventures inc) y se realizó PCR convencional utilizando los primers Bd1a y Bd2a (Annis et. al., 2004). Se obtuvo únicamente un resultado positivo para Bd en la especie Scinax ruber, que fue enviado a Macrogen Korea, para su posterior secuenciación. Se presenta la secuencia consenso de la región ITS rRNA obtenida mediante el software Geneious versión 6.0, correspondiente a Bd y se discuten las implicaciones de este resultado positivo para la zona.

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