Browsing by Author "Lara Cruz, Gustavo Adolfo"

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    In Silico Design of Tweezer-like Molecules for the Specific Detection of Sucrose at Ultra Low Concentration
    (Pontificia Universidad Javeriana Cali, 2025) Lara Cruz, Gustavo Adolfo; Jaramillo Botero, Andrés
    La cuantificación de Sacarosa (Suc) en condiciones reales de cultivo es crucial para el mejoramiento de plantas con mayor resiliencia a estreses bióticos y abióticos, especialmente en el contexto actuald de cambio climático. Muchos de los mecanismos de la sacarosa como molécula de señalizadora son desconocidos debido, en parte, a las limitaciones de los métodos actuales de cuantificación de sacarosa que alteran lo procesos biológicos de la planta durante la medición, y carecen de la resolución espaciotemporal necesaria para monitorear los niveles de sacarosa en diferentes tejidos vegetales. En consecuencia, establecer correlaciones entre las concentraciones de sacarosa y las respuestas metabólicas de la planta en condiciones de estrés sigue, siendo un problema abierto. Las moléculas tipo pinza basadas en ácidos diarilborónicos (ADB) presentan un alto potencial para el desarrollo de sensores para la cuantificación selectiva de la sacarosa en condiciones in vivo. Las pinzas de ADB reaccionan de manera reversible con carbohidratos, los productos de la reacción se pueden detectar utilizando transistores de efecto de campo, electroquímica, espectroscopia o técnicas de espectrofotometría, con un alto potencial para ser utilizados en pequeños dispositivos portátiles para mediciones de sacarosa en el campo. Las pinzas de ADB han demostrado su capacidad para la cuantificación selectiva de glucosa en condiciones in vivo. Sin embargo, actualmente no existe una metodología clara y sistemática para adaptar las pinzas de ADB a la detección selectiva de sacarosa, y el diseño de pinzas de ADB selectivas para carbohidratos específicos en ocasiones es producto de la serendipia. En este trabajo, abordamos el problema de la cuantificación selectiva de sacarosa en condiciones in vivo mediante el desarrollo de nuevos pinza moleculares de ADB para la reacción específica con sacarosa. Nuestro proceso de diseño empleó una estrategia de diseño inverso apoyada en cálculos de química cuántica para: (i) dilucidar la reactividad de la sacarosa con aDBs en medios acuosos, (ii) diseñar pinzas de ADB con la distancia y orientación precisa de los grupos borónicos para la unión selectiva de la sacarosa, e (iii) identificar las pinzas de ADB con mejores prestaciones, y sintéticamente accesibles, para la reacción con la sacarosa en condiciones fisiológicas. Se propuso un plan de síntesis para una de las pinzas ADB de mejores prestaciones, identificadas a través del diseño computacional. También, se planteó un esquema detallado para la implementacion experimental de las pinza de ADB diseñadas y su empleo para la cuantificación de la sacarosa. Nuestros resultados muestran que la reacción de ácidos arilborónicos (AaB) (ácido fenilborónico (AFB) y benzoxaborol (BOB)) con los grupos hidroxilo en las posiciones 1’,3’- y 4,6- de la sacarosa, producen complejos estables AaB−1−Suc−AaB−1 , caracterizados por anillos de seis miembros en una conformación de silla. La exploración de la superficie de energía potencial y cálculos de barreras de reaccción, indican que en condiciones de pH > pKa,AFB, el AFB−1 reacciona espontáneamente con la sacarosa en una escala de tiempo de minutos a horas. Los productos resultantes AaB−1−Suc−AaB−1 se emplearon como plantillas para el diseño inverso de pinzas de ADB, produciendo 1361 moléculas para la plantilla AFB−1 (S)−Suc−AFB−1 (S), donde “S” denota quiralidad del átomo de boro. Sin embargo, debido a la rigidez de las moléculas de BOB, no fue posible encontrar un fragmento molecular para que completa las pinzas ADB usando la plantilla BOB−1−Suc− BOB−1 . Por lo tanto, el proceso de diseño de pinzas de ADB continuó solo con moléculas de AFB. Se desarrolló un protocolo computacional semi-automático, para calcular las energías libres de reacción para las pinzas de ADB con carbohidratos. La validación del protocolo se realizó con datos experimentales para las reacciones de pinzas de ADB con glucosa y galactosa demostró una excelente exactitud (error absoluto medio de 2.2 kcal/mol) y precisión (2.4 kcal/mol), cerca del límite de la exactitud química. Esto permitió la selección de pinzas de ADB que reaccionan espontáneamente con sacarosa en medios acuosos en condiciones estándar. El proceso de diseño continuó mediante una optimización multiobjetivo basado en un algorítmo genético para la modificación de grafos moleculares (AG-GM), considerando la energía libre de para la reacción de pinzas de ADB con sacarosa, la solubilidad en agua, las constantes de acidez máxima de los fragmentos AaB, y un puntuje de la accesibilidad sintética (AS) de la pinza de ADB. La optimización multi-objetivo permitió el diseño de pinzas de ADB con un propiedades óptimas para la detección de sacarosa en condiciones fisiológicas, controlando al mismo tiempo la complejidad sintética de las pinzas diseñadas. Debido al alto costo computacional para calcular energías libres de reacción, la optimización multi-objetivo AG-GM se realizó utilizando un conjunto representativo de 32 pinzas de ADB. A partir de los resultados de nuestro diseño computacional, propusimos la síntesis de la pinza 1,5-bis(3- boronofenil)fenantreno como molécula de prueba para explorar la ruta de síntesis de una de las pinzas de nuestro diseño computacional. Aunque la síntesis de la molécula de prueba no se completó, la síntesis exitosa del 1,5-bis(3-metoxifenil)fenantreno nos permitió optimizar las condiciones de reacción para ensamblar la estructura atómica requerida para la molécula piloto. Sin embargo, se necesitan mejoras en la regioselectividad durante la síntesis de 1,5-diclorofenantreno en la etapa inicial del plan de síntesis. El plan de síntesis de la pinza 1,5-bis(3-boronofenil)fenantreno ofrece una vía para sintetizar el 1,5-bis(3- boronofenil)-8-aminofenantreno, que a su vez permite la funcionalización de electrodos de carbono impresos (ECI) a través de un protocolo de biofuncionalización utilizado en nuestro grupo. Este protocolo consiste en la funcionalización del electrodo de trabajo (ET) del ECI mediante ácido para-aminobenzóico (APAB), seguido de la activación del grupo carboxilo del APAB para formar un enlace peptídico con el 1,5- bis(3-boronofenil)-8-aminofenantreno. El progreso de la funcionalización se puede monitorear a través de caracterización electroquímica y microscopía de fuerza atómica, y los cambios de capacitancia en el ET debido a la formación del complejo pinza-sacarosa, pueden ser utilizados para cuantificar las concentraciones de sacarosa. Los sensores basados en moléculas tipo pinza de ADB diseñadas para la cuantificación de sacarosa, tienen un potencial significativo para el monitoreo continuo de los niveles de sacarosa in vivo o en soluciones fisiológicas. Esto generará información valiosa sobre el papel de la sacarosa como molécula de señalización, particularmente en condiciones de estrés biótico o abiótico. Este trabajo es base para el desarrollo de sensores de sacarosa en tiempo real para aplicaciones agrícolas y de otro tipo, lo que permite avances en la ciencia vegetal, como correlaciones genotipo-fenotipo, identificación de vías de señalización y mecanismos de respuesta al estrés, mejorando así las estrategias de mejoramiento de cultivos para la productividad sostenible y la seguridad alimentaria. Además, el marco de diseño computacional desarrollado aquí se puede adaptar sin problemas para el diseño de pinzas de ADB para otros monosacáridos y disacáridos, allanando el camino para mediciones simultáneas de carbohidratos in vivo, un paso crucial hacia la comprensión de las redes metabólicas que involucran carbohidratos en organismos vivos.