In Silico Design of Tweezer-like Molecules for the Specific Detection of Sucrose at Ultra Low Concentration

Lara Cruz, Gustavo Adolfo

In Silico Design of Tweezer-like Molecules for the Specific Detection of Sucrose at Ultra Low Concentration

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Date

2025

Authors

Lara Cruz, Gustavo Adolfo

Director

Jaramillo Botero, Andrés

Publisher

Pontificia Universidad Javeriana Cali

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Abstract

La cuantificación de Sacarosa (Suc) en condiciones reales de cultivo es crucial para el mejoramiento de plantas con mayor resiliencia a estreses bióticos y abióticos, especialmente en el contexto actuald de cambio climático. Muchos de los mecanismos de la sacarosa como molécula de señalizadora son desconocidos debido, en parte, a las limitaciones de los métodos actuales de cuantificación de sacarosa que alteran lo procesos biológicos de la planta durante la medición, y carecen de la resolución espaciotemporal necesaria para monitorear los niveles de sacarosa en diferentes tejidos vegetales. En consecuencia, establecer correlaciones entre las concentraciones de sacarosa y las respuestas metabólicas de la planta en condiciones de estrés sigue, siendo un problema abierto. Las moléculas tipo pinza basadas en ácidos diarilborónicos (ADB) presentan un alto potencial para el desarrollo de sensores para la cuantificación selectiva de la sacarosa en condiciones in vivo. Las pinzas de ADB reaccionan de manera reversible con carbohidratos, los productos de la reacción se pueden detectar utilizando transistores de efecto de campo, electroquímica, espectroscopia o técnicas de espectrofotometría, con un alto potencial para ser utilizados en pequeños dispositivos portátiles para mediciones de sacarosa en el campo. Las pinzas de ADB han demostrado su capacidad para la cuantificación selectiva de glucosa en condiciones in vivo. Sin embargo, actualmente no existe una metodología clara y sistemática para adaptar las pinzas de ADB a la detección selectiva de sacarosa, y el diseño de pinzas de ADB selectivas para carbohidratos específicos en ocasiones es producto de la serendipia. En este trabajo, abordamos el problema de la cuantificación selectiva de sacarosa en condiciones in vivo mediante el desarrollo de nuevos pinza moleculares de ADB para la reacción específica con sacarosa. Nuestro proceso de diseño empleó una estrategia de diseño inverso apoyada en cálculos de química cuántica para: (i) dilucidar la reactividad de la sacarosa con aDBs en medios acuosos, (ii) diseñar pinzas de ADB con la distancia y orientación precisa de los grupos borónicos para la unión selectiva de la sacarosa, e (iii) identificar las pinzas de ADB con mejores prestaciones, y sintéticamente accesibles, para la reacción con la sacarosa en condiciones fisiológicas. Se propuso un plan de síntesis para una de las pinzas ADB de mejores prestaciones, identificadas a través del diseño computacional. También, se planteó un esquema detallado para la implementacion experimental de las pinza de ADB diseñadas y su empleo para la cuantificación de la sacarosa. Nuestros resultados muestran que la reacción de ácidos arilborónicos (AaB) (ácido fenilborónico (AFB) y benzoxaborol (BOB)) con los grupos hidroxilo en las posiciones 1’,3’- y 4,6- de la sacarosa, producen complejos estables AaB−1−Suc−AaB−1 , caracterizados por anillos de seis miembros en una conformación de silla. La exploración de la superficie de energía potencial y cálculos de barreras de reaccción, indican que en condiciones de pH > pKa,AFB, el AFB−1 reacciona espontáneamente con la sacarosa en una escala de tiempo de minutos a horas. Los productos resultantes AaB−1−Suc−AaB−1 se emplearon como plantillas para el diseño inverso de pinzas de ADB, produciendo 1361 moléculas para la plantilla AFB−1 (S)−Suc−AFB−1 (S), donde “S” denota quiralidad del átomo de boro. Sin embargo, debido a la rigidez de las moléculas de BOB, no fue posible encontrar un fragmento molecular para que completa las pinzas ADB usando la plantilla BOB−1−Suc− BOB−1 . Por lo tanto, el proceso de diseño de pinzas de ADB continuó solo con moléculas de AFB. Se desarrolló un protocolo computacional semi-automático, para calcular las energías libres de reacción para las pinzas de ADB con carbohidratos. La validación del protocolo se realizó con datos experimentales para las reacciones de pinzas de ADB con glucosa y galactosa demostró una excelente exactitud (error absoluto medio de 2.2 kcal/mol) y precisión (2.4 kcal/mol), cerca del límite de la exactitud química. Esto permitió la selección de pinzas de ADB que reaccionan espontáneamente con sacarosa en medios acuosos en condiciones estándar. El proceso de diseño continuó mediante una optimización multiobjetivo basado en un algorítmo genético para la modificación de grafos moleculares (AG-GM), considerando la energía libre de para la reacción de pinzas de ADB con sacarosa, la solubilidad en agua, las constantes de acidez máxima de los fragmentos AaB, y un puntuje de la accesibilidad sintética (AS) de la pinza de ADB. La optimización multi-objetivo permitió el diseño de pinzas de ADB con un propiedades óptimas para la detección de sacarosa en condiciones fisiológicas, controlando al mismo tiempo la complejidad sintética de las pinzas diseñadas. Debido al alto costo computacional para calcular energías libres de reacción, la optimización multi-objetivo AG-GM se realizó utilizando un conjunto representativo de 32 pinzas de ADB. A partir de los resultados de nuestro diseño computacional, propusimos la síntesis de la pinza 1,5-bis(3- boronofenil)fenantreno como molécula de prueba para explorar la ruta de síntesis de una de las pinzas de nuestro diseño computacional. Aunque la síntesis de la molécula de prueba no se completó, la síntesis exitosa del 1,5-bis(3-metoxifenil)fenantreno nos permitió optimizar las condiciones de reacción para ensamblar la estructura atómica requerida para la molécula piloto. Sin embargo, se necesitan mejoras en la regioselectividad durante la síntesis de 1,5-diclorofenantreno en la etapa inicial del plan de síntesis. El plan de síntesis de la pinza 1,5-bis(3-boronofenil)fenantreno ofrece una vía para sintetizar el 1,5-bis(3- boronofenil)-8-aminofenantreno, que a su vez permite la funcionalización de electrodos de carbono impresos (ECI) a través de un protocolo de biofuncionalización utilizado en nuestro grupo. Este protocolo consiste en la funcionalización del electrodo de trabajo (ET) del ECI mediante ácido para-aminobenzóico (APAB), seguido de la activación del grupo carboxilo del APAB para formar un enlace peptídico con el 1,5- bis(3-boronofenil)-8-aminofenantreno. El progreso de la funcionalización se puede monitorear a través de caracterización electroquímica y microscopía de fuerza atómica, y los cambios de capacitancia en el ET debido a la formación del complejo pinza-sacarosa, pueden ser utilizados para cuantificar las concentraciones de sacarosa. Los sensores basados en moléculas tipo pinza de ADB diseñadas para la cuantificación de sacarosa, tienen un potencial significativo para el monitoreo continuo de los niveles de sacarosa in vivo o en soluciones fisiológicas. Esto generará información valiosa sobre el papel de la sacarosa como molécula de señalización, particularmente en condiciones de estrés biótico o abiótico. Este trabajo es base para el desarrollo de sensores de sacarosa en tiempo real para aplicaciones agrícolas y de otro tipo, lo que permite avances en la ciencia vegetal, como correlaciones genotipo-fenotipo, identificación de vías de señalización y mecanismos de respuesta al estrés, mejorando así las estrategias de mejoramiento de cultivos para la productividad sostenible y la seguridad alimentaria. Además, el marco de diseño computacional desarrollado aquí se puede adaptar sin problemas para el diseño de pinzas de ADB para otros monosacáridos y disacáridos, allanando el camino para mediciones simultáneas de carbohidratos in vivo, un paso crucial hacia la comprensión de las redes metabólicas que involucran carbohidratos en organismos vivos.

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The ability to measure Sucrose (Suc) under real crop-field conditions is crucial for breeding plant species with enhanced resilience to biotic and abiotic stresses in the context of climate change. Many roles of sucrose as a signaling molecule remain poorly understood, partly due to limitations in current quantification methods. These methods often disrupt normal plant functioning during measurement and lack the spatiotemporal resolution required to monitor sucrose levels across different plant tissues. Consequently, establishing correlations between sucrose concentrations and plant metabolic responses under stress conditions remains a significant challenge. Among the potential approaches for selective sucrose quantification under in vivo conditions, tweezer-like molecules based Diarylboronic Acid (DBA) present a promising solution. DBA tweezers react reversibly with carbohydrates, the reaction products can be detected using field effect transistors, electrochemistry, spectroscopy, or spectrophotometry techniques, with high potential to be used in small portable devices for on-field measurements of sucrose. DBA tweezers have demonstrated the capability for selective glucose quantification under in vivo conditions. However, a clear and systematic methodology for adapting DBA tweezers to the selective detection of sucrose is currently lacking, with the discovery of selective DBA tweezers for specific carbohydrates often relying on serendipity. In this work, we addressed the challenge of achieving accurate and selective sucrose quantification under in vivo conditions by developing novel tweezer-like DBA molecules tailored for specific reactions with sucrose. Our design process employed an inverse design strategy supported by quantum chemistry calculations to: (i) elucidate the reactivity of sucrose with Arylboronic Acid (aBA) molecules in aqueous media, (ii) design DBA tweezers with optimized distance and orientation of boronic groups for selective sucrose binding, and (iii) identify the best-performing, synthetically accessible DBA tweezers for reaction with sucrose under controlled physiological conditions. A synthesis plan was proposed for one of the top-performing DBA tweezers identified through computational design, along with a detailed outline of a feasible methodology for its experimental implementation in sucrose quantification. Our results show that the reaction of aBA molecules (Phenylboronic Acid (PBA) and Benzoxaborole (BOB)) with hydroxyl groups at the 1’,3’- and 4,6-positions of sucrose produces stable aBA−1−Suc−aBA−1 complexes, characterized by six-membered rings in a chair conformation. Nudged Elastic Band-Climbing Image (NEB-CI) and Transition State (TS) optimizations indicate that at pH > pKa,PBA conditions, PBA−1 reacts spontaneously with sucrose on a time scale of minutes to hours under these conditions. The resulting aBA−1−Suc−aBA−1 products served as scaffolds for the inverse design of DBA tweezers, yielding 1361 designs based on the scaffold PBA−1 (S)−Suc− PBA−1 (S), where “S” denotes boron-atom chirality. However, the rigidity of BOB moieties in BOB−1−Suc− BOB−1 hindered molecular fragment matching to complete the DBA tweezers, leading to the continuation of the design process with DBA tweezers based on PBA moieties. A state-of-the-art, semi-automated computational workflow was developed to calculate reactionfree energies for DBA tweezers with carbohydrates. Validation against experimental data for reactions with glucose and galactose demonstrated excellent accuracy (mean absolute error of 2.2 kcal/mol) and precision (2.4 kcal/mol), close to the limit of chemical accuracy. This enabled the screening of DBA tweezers that react spontaneously with sucrose in aqueous media under standard conditions. The design process was further refined through a Graph Based-Genetic Algorithm (GB-GA) multi-objective optimization, considering the free energy for the DBAtweezer+Suc reaction, water solubility, maximum acidity constants of aBA moieties, and a Synthetic Accesibility (SA) score for the DBA tweezer. This approach effectively designed DBA tweezers with optimal properties for sucrose quantification under physiological conditions, while managing synthetic complexity of the DBA tweezers. Due to the high computational cost of calculating reaction-free energies, the GB-GA multi-objective optimization was conducted using a representative set of 32 DBA tweezers. Based on our computational design results, we proposed the synthesis of the DBA tweezer 1,5-bis(3-boronophenyl)phenanthrene as a pilot molecule to explore the synthesis route for producing one of the top-performing DBA tweezers. Although the synthesis of the pilot molecule was not completed, the successful synthesis of 1,5-bis(3-methoxyphenyl)phenanthrene enabled us to optimize the reaction conditions for assembling the atomic backbone required for the pilot molecule. However, improvements are needed in the regioselectivity during the synthesis of 1,5-dichlorophenanthrene in the initial stage of the synthesis plan. The synthesis plan for DBA tweezer 4 and 1,5-bis(3- boronophenyl)phenanthrene offers a pathway for synthesizing 1,5-bis(3-boronophenyl)-8- aminophenanthrene, enabling Screen-Printed Carbon Electrode (SPCE) functionalization through a biofunctionalization protocol used in our group. This involves surface grafting with para-Aminobenzoic Acid (PABA), followed by activation of PABA’s carboxyl group to form a peptidic bond with the 1,5-bis(3- boronophenyl)-8-aminophenanthrene. Functionalization progress can be monitored via electrochemical characterization and atomic force microscopy, and the capacitance changes in the Working Electrode (WE) due the DBA tweezer-sucrose complex, can be used to quantify sucrose concentrations. Sensors based on tweezer-like DBA molecules tailored for sucrose quantification hold significant potential for continuous monitoring of sucrose levels in vivo or in physiological solutions. They offer valuable insights into sucrose’s role as a signaling molecule, particularly under biotic or abiotic stress conditions. This work directly supports the development of real-time sucrose sensors for agricultural and other applications, enabling advances in plant science, such as genotype-phenotype correlations, signaling pathway identification, and stress response mechanisms, thereby enhancing crop breeding strategies for sustainable productivity and food security. Furthermore, the computational design framework developed here can be seamlessly adapted for the design of DBA tweezers for other monosaccharides and disaccharides, paving the way for simultaneous carbohydrate measurements in vivo—a crucial step toward understanding metabolic networks involving carbohydrates in living organisms.