Exploración de los mecanismos moleculares relacionados con el rol antioxidante y el potencial antiproliferativo de extractos obtenidos de subproductos de la industria azucarera
Loading...
Date
2023
Authors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Pontificia Universidad Javeriana Cali
Abstract
En un contexto social cada vez más orientado hacia el desarrollo sostenible, el uso racional de los recursos naturales y la minimización de impactos negativos al medio ambiente, la investigación aplicada ha experimentado un notable avance para abordar problemáticas relacionadas con la transformación de materias primas a nivel industrial y su inevitable generación de residuos. La incorporación de principios propios de la investigación científica ha conducido a la formulación de estrategias integradoras y holísticas para darle a estos materiales residuales una segunda oportunidad para ser aprovechados en función de sus potencialidades. En este marco de referencia, el presente trabajo doctoral está alineado con la creciente tendencia hacia la sostenibilidad y la revalorización de subproductos agroindustriales. A través de la implementación de un enfoque interdisciplinario que combina elementos de la química analítica, la biología celular, la biología molecular y la bioinformática, este estudio ofrece un valioso entendimiento de la versatilidad y el potencial terapéutico de dos subproductos aparentemente descartables de la agroindustria de la caña de azúcar: las melazas y las vinazas. Al evaluar las características fisicoquímicas y los efectos biológicos de extractos derivados de estas dos fuentes, se busca comprender los aspectos mecanísticos que podrían conferirles un importante valor científico con posibles aplicaciones futuras. En este sentido, el objetivo principal de esta investigación consistió en explorar los mecanismos moleculares subyacentes al rol antioxidante y al potencial antiproliferativo de extractos obtenidos a partir de la melaza y la vinaza de caña.
Como primer paso para alcanzar este objetivo, se procedió a la caracterización fisicoquímica de ambos subproductos. Posteriormente, se sometieron a un proceso de extracción en fase sólida, del cual se derivaron dos fracciones por cada subproducto: una fracción metanólica, que se esperaba contuviera principalmente compuestos fenólicos (PCs), y otra fracción acuosa, en la cual estarían presentes compuestos inducidos por el calor (HICs). Cada fracción se caracterizó en términos de su contenido de compuestos antioxidantes totales, capacidad antioxidante in vitro y perfil de compuestos de interés. La identificación tentativa de estos compuestos se realizó aplicando técnicas de cromatografía líquida (LC) y de gases (GC) acopladas a espectrometría de masas de alta resolución (MS/MS). En consecuencia, los PCs fueron identificados en los extractos metanólicos por LC-MS/MS, mientras que los extractos acuosos se procesaron por GC-MS/MS para determinar su composición de compuestos volátiles generados térmicamente (HICs).
Los resultados de esta caracterización fisicoquímica confirmaron que tanto la melaza como la vinaza de caña son ricas en diversos compuestos bioactivos. En las fracciones metanólicas se encontraron compuestos como el ácido p-cumárico, el schaftósido, el ácido clorogénico y el ácido feruloilquínico; mientras que en los extractos acuosos se identificaron compuestos como la DDMP, el 1-butoxi-2-propanol, el ácido isociánico, el 3,4-dimetoxifenol y la 1,6-anhidro-beta-D-glucopiranosa. A pesar de estas diferencias composicionales, los análisis demostraron que el tipo de subproducto no influyó significativamente en los contenidos de compuestos antioxidantes totales, por lo que estos hallazgos posicionan a la melaza y la vinaza de caña como materiales con cualidades antioxidantes comparables.
Tras el análisis químico de los extractos, se realizó la determinación de sus efectos biológicos en un contexto celular específico. Para ello, se examinó la respuesta antiproliferativa de células NIH-3T3 tratadas con los extractos más sobresalientes del paso anterior. Como resultado de estos ensayos, se seleccionaron los cultivos celulares con la mejor respuesta diferencial a los tratamientos aplicados, y se realizó la respectiva evaluación de los cambios en los patrones de expresión génica. Para este fin, se realizó un estudio transcriptómico comparativo aplicando técnicas de secuenciación por RNA-Seq para identificar los transcritos diferencialmente expresados. Con los datos obtenidos se implementó un flujo de trabajo bioinformático que incluyó la anotación funcional de los genes basada en ontologías génicas, un análisis de enriquecimiento funcional mediante las rutas metabólicas de la base de datos KEGG, y un análisis de redes de interacción proteína-proteína. A través de esta metodología se evidenció una influencia notable de los extractos en la proliferación celular. A nivel molecular, los resultados revelaron modificaciones significativas y generalizadas en la expresión génica de procesos biológicos, componentes celulares, funciones moleculares, rutas metabólicas y redes de interacción proteica relacionadas con la matriz extracelular y la membrana citoplasmática. Algo destacable de estos hallazgos, fue que, aunque los conjuntos de genes diferencialmente expresados variaron en cada caso, se encontró que los extractos provenientes de ambos subproductos evaluados afectaron casi los mismos eventos celulares de una forma dependiente del tiempo.
Posteriormente, se examinó la influencia de los extractos sobre marcadores moleculares característicos de los procesos de ciclo celular y apoptosis mediante análisis de expresión génica por qPCR. Como producto de estas pruebas se detectaron disminuciones significativas en la expresión de genes reguladores maestros del ciclo celular tales como CCNA1 y CCNB1, los cuales desempeñan un rol esencial en la progresión de las fases S, G2 y M. Aunque se observaron cambios en la transcripción de genes relacionados con la apoptosis, no fue posible confirmar que las células hubieran desplegado completamente una muerte programada por vía mitocondrial. Estos hallazgos, junto con la pérdida de viabilidad celular observada en los ensayos antiproliferativos, plantean la necesidad de emprender estudios adicionales para investigar otros tipos de muerte celular.
Considerando las afectaciones observadas sobre el ciclo celular y la apoptosis en la línea celular NIH-3T3, se replicó un estudio semejante en células cancerosas de la línea HT-29. Los resultados obtenidos en este contexto neoplásico reflejaron similitudes significativas con los hallazgos previamente observados en las células no cancerosas; de aquí que se pudieran demostrar las propiedades antiproliferativas de los extractos para los dos entornos celulares estudiados.
A la luz de los resultados globales de esta tesis doctoral, se ha proporcionado evidencia relevante que demuestra las posibilidades que las melazas y vinazas de caña pueden ofrecer como fuentes de compuestos biológicamente activos. La capacidad antioxidante inherente de estos extractos, respaldada por la presencia de PCs y HICs, sugiere su utilidad en la prevención del daño celular inducido por radicales libres. Adicionalmente, el impacto en la proliferación celular plantea perspectivas interesantes para el futuro diseño de terapias antiproliferativas, incluso en el ámbito oncológico. Aunque persisten interrogantes sobre los mecanismos tras los efectos observados, este estudio establece los cimientos para investigaciones posteriores en esta dirección. Finalmente, esta investigación demuestra lo prometedor que puede resultar el uso de subproductos industriales para aprovechar sus cualidades como fuente de agentes bioactivos. Además de los beneficios ambientales y económicos que podrían derivarse de esta revalorización, los hallazgos obtenidos tienen el potencial de impulsar avances científicos significativos en los campos de la medicina y la biotecnología.
Description
item.page.descriptioneng
In a social context increasingly oriented towards sustainable development, rational use of natural resources, and minimization of negative impacts on the environment, applied research has undergone notable advancements in addressing issues related to the industrial transformation of raw materials and their inevitable generation of waste. Incorporating scientific research principles has led to the formulation of integrative and holistic strategies to provide these waste materials a second chance to be used according to their potential Within this framework, the present doctoral dissertation aligns with the growing trend towards sustainability and revalorization of agro-industrial by-products. By implementing an interdisciplinary approach that combines elements of analytical chemistry, cell biology, molecular biology, and bioinformatics, this study provides valuable insights into the versatility and therapeutic potential of two seemingly discarded by-products from the sugarcane agroindustry: molasses and vinasse. By evaluating the physicochemical characteristics and biological effects of extracts derived from these two sources, the aim is to understand the mechanistic aspects that could confer significant scientific value with potential future applications. In this regard, the main purpose of this research was to explore the underlying molecular mechanisms behind the antioxidant role and the antiproliferative potential of extracts obtained from sugarcane molasses and vinasse.
The physicochemical characterization of both byproducts was conducted as a first step toward achieving this objective. Subsequently, they were subjected to a solid-phase extraction process, yielding two fractions for each byproduct: a methanolic fraction, expected to mainly contain phenolic compounds (PCs), and an aqueous fraction, where heat-induced compounds (HICs) were anticipated. Each fraction was characterized in terms of its content of total antioxidant compounds, in vitro antioxidant capacity, and profile of compounds of interest. Tentative identification of these compounds was performed by applying liquid chromatography (LC) and gas chromatography (GC) techniques coupled with high-resolution mass spectrometry (MS/MS). Consequently, PCs were identified in methanolic extracts by LC-MS/MS, while aqueous extracts were processed through GC-MS/MS to determine their composition of thermally generated volatile compounds (HICs).
The results of this physicochemical characterization confirmed that both sugarcane molasses and vinasse are rich in diverse bioactive compounds. Methanolic fractions revealed compounds such as p-coumaric acid, schaftoside, chlorogenic acid, and feruloylquinic acid, whereas aqueous extracts identified compounds like DDMP, 1-butoxy-2-propanol, isocyanic acid, 3,4-dimethoxyphenol, and 1,6-anhydro-beta-D-glucopyranose. Despite these compositional differences, analyses demonstrated that the type of by-product did not significantly influence the contents of total antioxidant compounds, thereby positioning molasses and vinasse as materials with comparable antioxidant qualities.
Following the chemical analysis of the extracts, the determination of their biological effects in a specific cellular context was conducted. For this purpose, the antiproliferative response of NIH-3T3 cells treated with the most prominent extracts from the previous step was examined. As a result of these assays, cell cultures displaying the most differential response to the applied treatments were selected, and the respective assessment of changes in gene expression patterns was performed. For this purpose, a comparative transcriptomic study was conducted using RNA-Seq to identify the differentially expressed transcripts. With the obtained data, a bioinformatic workflow was implemented, encompassing functional annotation of genes based on gene ontologies, functional enrichment analysis using KEGG pathway databases, and protein-protein interaction network analysis. Through this methodology, a notable influence of the extracts on cell proliferation was revealed. At a molecular level, the results unveiled significant and widespread alterations in gene expression involving biological processes, cellular components, molecular functions, metabolic pathways, and protein interaction networks related to the extracellular matrix and cytoplasmic membrane. Noteworthy among these findings was the observation that although the sets of differentially expressed genes varied in each case, extracts from both evaluated by-products impacted nearly the same cellular events in a time-dependent manner.
Subsequently, the influence of the extracts on molecular markers characteristic of the cell cycle and apoptosis processes was examined through gene expression analysis via qPCR. As a result of these tests, significant decreases in the expression of master regulatory genes of the cell cycle, such as CCNA1 and CCNB1, which play an essential role in the progression of the S, G2, and M phases, were detected. Although changes in the transcription of genes related to apoptosis were observed, it was not possible to confirm that the cells had fully deployed mitochondrial programmed death. These findings and the observed loss of cell viability in antiproliferative assays suggest further studies exploring other forms of cell death.
Considering the observed effects on cell cycle and apoptosis in the NIH-3T3 cell line, a similar study was replicated in cancer cells of the HT-29 cell line. The results obtained in this neoplastic context reflected significant similarities with the previously observed findings in non-cancerous cells, thus demonstrating the antiproliferative properties of the extracts for both studied cellular environments.
In light of the overall results of this doctoral dissertation, relevant evidence has been provided that demonstrates the potential of sugarcane molasses and vinasse as sources of biologically active compounds. The inherent antioxidant capacity of these extracts, supported by the presence of PCs and HICs, suggests their usefulness in preventing cellular damage induced by free radicals. Additionally, the impact on cell proliferation raises exciting prospects for future design of antiproliferative therapies, even in the oncological realm. Although some questions regarding the mechanisms behind the observed effects persist, this study lays the foundation for further research in this direction. Finally, this research demonstrates the promising nature of using industrial by-products to exploit their qualities as a source of bioactive agents. Beyond the environmental and economic benefits that could be derived from this revalorization, the obtained findings can potentially drive significant scientific advancements in the medicine and biotechnology fields.
Keywords
Melazas, Vinazas, Compuestos fenólicos (PCs), Compuestos inducidos por el calor (HICs), Transcriptómica, proliferación celular, Apoptosis